Nacida en el siglo XII como eje vertebral de la judería, la Calle Mayor es aún hoy la principal vía de la ciudad. Es su carácter comercial la que hizo que se crearan sus característicos soportales ya desde sus inicios, siendo la calle soportalada más larga de España y una de las más largas de todo el mundo. Originalmente creada en madera y con galería abierta en la primera planta, fue el Cardenal Cisneros quien ordenó cambiar los pies de madera por columnas de piedra creadas ex profeso o traídas de Complutum. En el siglo XIX, a raíz de una serie de trabajos urbanísticos, se cambiaron la mayoría por los pilares cuadrados que inundan hoy la mayoría de la vía.
En la Calle Mayor aún quedan vestigios de ese pasado judío, como algunos adarves a antiguas corralas o las mirillas. De entre sus edificios destacan el Museo Casa Natal de Cervantes, aunque originalmente no tuviera acceso por esta vía, o el Hospital de Nuestra Señora de la Misericordia o de Antezana, el hospital gratuito más antiguo de Europa.